🧬 景明 ECHO｜核酸藥物基礎課
核酸藥物基礎課：寡核苷酸合成中的保護基策略—鹼基與糖環的正交保護體系
人工核酸合成的發展史，某種程度上就是保護基（Protecting Group）化學的演進史。核酸分子中同時具有胺基、羥基、磷酸基等多種活性官能團，如果沒有選擇性地「暫時封住」不希望反應的位置，每一步合成都可能產生大量副反應，導致最終產物純度下降、收率降低，甚至無法完成長鏈寡核苷酸的合成。因此，保護基策略成為固相寡核苷酸合成最重要的化學基礎。
什麼是正交保護（Orthogonal Protection）？
核酸合成遵循固定流程：保護單體 → 去除特定位點保護基 → 偶聯下一個核苷酸 → 重複延伸 → 最後一次性完全去保護。
不同保護基必須能用不同條件獨立去除。例如：
- ✓ 去除糖環保護基時，鹼基不能掉。
- ✓ 去除鹼基保護基時，DMTr 不能提前脫落。
- ✓ RNA 的 2’ 保護基也必須保持穩定。
一、鹼基保護（Base Protection）
天然核酸中：Adenine（A）、Guanine（G）、Cytosine（C）都具有環外胺基（Exocyclic Amino Group）。若沒有保護，容易在偶聯反應中發生副反應。因此必須加入保護基。而 Thymine（T）、Uracil（U）沒有反應性胺基，通常不需要保護。
最常見的是酰基保護：
- • Benzoyl (Bz)
- • Acetyl (Ac)
- • Isobutyryl (iBu)
特色：對酸穩定、對偶聯反應穩定，最後可利用氨水去除。一般脫保護條件：約 50°C 濃氨水 5 小時即可恢復天然鹼基。
Guanine 常使用 dmf（Dimethylformamidine） 作為保護基。
優點：比 iBu 更容易脫除，大幅縮短最終去保護時間。目前已廣泛應用於商業核酸合成。
若核酸具有：螢光染劑、生物素、PEG 或特殊修飾，一般濃氨水容易破壞修飾。因此改用：
- • Ac
- • Pac
- • iPrPac
搭配 NH₃／CH₃NH₂ 即可在室溫完成去保護，非常適合核酸藥物。
二、糖環保護（Sugar Protection）
DNA 與 RNA 最大差異：DNA 只有 3’、5’ OH；RNA 多了一個 2’ OH，因此 RNA 的保護策略更加困難。
目前全球標準為 DMTr：
- ✓ 專一保護 5’ OH：因為 5’ 是一級醇，比 2’、3’ 更容易反應。
- ✓ 酸敏保護基：使用 2～3% DCA 或 TCA 即可快速去除。
脫保護時 DMTr⁺ 會形成漂亮的橘紅色陽離子。因此核酸合成儀可以直接監測：每一步偶聯是否成功。
RNA 多出的 2’ OH 如果沒有封住，容易發生副反應、降低偶聯效率、造成 RNA 降解。因此必須加入矽基保護。目前兩種主流：
- • TBDMS（tert-Butyldimethylsilyl）：最經典，也是目前最廣泛使用。
- • TOM（Triisopropylsilyloxymethyl）：另一種 RNA 合成保護基。具有去保護效率高、合成效率佳等特色，近年商業 RNA 合成也十分常見。
如何去除矽基？
利用 TBAF（Tetrabutylammonium Fluoride） 提供氟離子，即可專一切斷 Si-O 鍵。完全不影響 DMTr 與鹼基保護，真正做到正交脫保護。
三、完整的正交保護網路
整個核酸合成，可視為三套互不干擾的保護系統：
-
鹼基保護 使用：Bz、Ac、iBu、dmf氨水／甲胺脫除
-
5’ 保護 使用：DMTr弱酸（DCA／TCA）脫除
-
RNA 2’ 保護 使用：TBDMS、TOMTBAF 脫除
三者互不干擾，才能讓每一步反應都只發生在預期位置。
- ✓ 正交保護是寡核苷酸合成的核心概念。
- ✓ A、G、C 需要鹼基保護；T、U 通常不需保護。
- ✓ DMTr 是目前最重要的 5’ 保護基，也是固相合成的重要監測指標。
- ✓ RNA 因多出 2’ OH，需要額外使用 TBDMS 或 TOM 保護。
- ✓ 酸、鹼與氟離子三種不同脫保護條件，共同建立完整的正交保護體系。
景明 ECHO 小知識：
保護基的角色，就像施工時的「遮蔽膠帶」。在需要反應的位置先露出，其餘位置暫時封住；待每一步完成後，再依照不同條件逐一拆除。正因為有這套精密的正交保護策略，現代固相合成才能實現自動化、高純度且高效率地製備 DNA、RNA 與各類核酸藥物。
